人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）产品说明书

【产品名称】

人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

【包装规格】

24 人份/盒；48 人份/盒。

【预期用途】

本产品用于体外定性检测人全血样本中的人类免疫缺陷病毒 1 型脱氧核糖核酸（HIV-1DNA）（仅 M 组）。 本产品用于 HIV-1 型（M 组）感染的辅助诊断。

人类免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）感染是严重危害人类健康的全球问题， 自 1981 年在美国被识别并发展为全球大流行至今，已累计结果几千万人死亡。HIV-1DNA 检测可用于人群HIV-1  抗体筛查有反应性结果的确证检测及高危人群抗体筛查无反应性结果的筛查（窗口期），用于 HIV 抗体检测不确 定结果的辅助诊断。

本产品仅用于 HIV-1  型感染的辅助诊断，临床医生可参考本产品检测结果，结合病例的实际情况及多方检 查结果开展综合判断。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。本试剂盒不可作 为血液或血液制品 HIV 筛查使用。

【检验原理】

本试剂盒利用荧光 PCR 技术，针对人类免疫缺陷病毒 1 型基因设计特异性引物与探针，配以热启动 DNA 聚合酶等成分组成核酸扩增试剂，使用荧光 PCR 仪开展 PCR 扩增，并检测荧光信号，从而对 HIV-1  DNA 开展 检测。

本试剂盒添加了相关的防污染组分（尿嘧啶糖基化酶），其作用机理是选择性水解断裂含有 dU  的双链或者 单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的 DNA 链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而 被消除。

【主要组成成分】

注：（1）不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。

（2）需自备的试剂：核酸提取或纯化试剂，使用本公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备 20170666 号）。

（3）质控品说明：HIV-1 DNA 阳性质控品为 8E5 细胞核酸与含HIV-1 DNA 内标片段的质粒，阴性质控品 为纯化水，不具有生物活性，但使用时均应视为具有潜在传染性的物质，操作与处理均需符合相关法规要求。

【储存条件及有效期】

试剂盒保存于-20±5℃,有效期为 12 个月。

试剂盒应避免反复冻融，反复冻融次数不超过 8 次；在 2~8℃下可以保存 14 天；在 37℃下可以保存 72 小 时；开瓶次数不超过 4 次；-20±5℃运输条件下 6 天内不影响本试剂盒的检测性能。

试剂盒生产日期与失效日期见产品标签。

【适用仪器】

ABI 7500 ，AGS4800 ，BIO-RAD CFX96 Deep Well

【样本要求】

1.  适用样本：人全血样本。

2.  样本采集：抽取受检者静脉血不少于 1 mL 注入 EDTA 抗凝管中，立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10 次，使 抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。

3.  样本的保存：可立即用于核酸提取。提取前样本保存：在 2～8℃保存期为 1 个月；在-20±5℃保存期为 12 个月；在-70±5℃保存期为 5 年。样本反复冻融不超过 5 次。提取后核酸保存：在 2～8℃保存期为 24 小时； 在-20±5℃保存期为 30 天；在-70±5℃或-80±5℃保存期为 24 个月。

【检验方法】

1.PCR 试剂准备（试剂准备区）

从试剂盒中取出 HIV-1DNA 反应液 A、HIV-1 DNA 反应液 B、HIV-1 DNA 内标溶液、阴性质控品、HIV-1 DNA 阳性质控品，室温融化后振荡混匀，瞬时离心数秒后使用。

取 N 个（N＝待测样本个数+阴性质控品+HIV-1DNA 阳性质控品）反应管，

单人份 PCR 反应液配制如下表：

将各组分充分混合，3,000 rpm 离心数秒，将管壁上的液体全部离心至管底，将 20μL 反应液分装到 PCR 管 中即可。如分装好的 PCR 反应液不立即使用应放置在 2～8℃不超过4 小时，室温放置不应超过 1 小时。

2.样本处理与核酸提取（样本制备区）

按照基于本公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备 20170666 号），具体操作步骤请按照试剂盒说明 书指引开展，阴性质控品需要与待测样本同步开展处理。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，用于提取过程及 PCR 扩增全过程的监控，若提取试剂说明书中未说明内标的使用方法，每个测试应加入 5 µLHIV-1 DNA 内标溶 液后开展核酸提取。建议按照基于分光光度计（如 NanoDrop2000 超微量分光光度计或其他分光光度计仪器）对提取 后的核酸开展检测，核酸的纯度应满足 A260/A280 比值范围在 1.6~2.2 之间。

本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境开展监控。

3.  加样（样本制备区）

往分装有 20 µL 扩增体系的 PCR 反应管中分别加入阴性质控品、HIV-1 DNA 阳性质控品与待测样本核酸（推 荐浓度相较而言更多 20 ng/µL）各 40 µL，使各反应总体积为 60 µL。盖紧管盖，瞬时离心后转移至扩增检测区。

4.PCR 扩增（PCR 扩增区）

4.1  将 PCR  反应管放入仪器样品槽内。

4.2  仪器设置

4.2.1  ABI 7500 仪器设置

1）先开电脑，再开定量 PCR  仪主机电源，最后启动 ABI 7500 软件。

2）新建文件：菜单 File  → New Experiment  中选择 Advanced Setup，打开一个空白文件，在“Experiment Name ” 中编辑实验名。

3）打开“Plate Setup”窗口，点击 Add New Target 按钮，新建探针，探针检测模式设置为：Reporter 1：FAM，Quencher

1 ：none，Reporter 2 ：VIC  ，Quencher    2 ：none；点击“Assign Target Samples”按钮，按样本对应顺序设置阴性  质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknown），并在“Sample Name ”一栏中设置样本名称，Passive Reference： none。

4）打开 Run Method 窗口，设置反应体积为 60 µL，并设置循环条件如下：

5）设置完成后，保存文件，运行程序。

4.2.2 AGS4800 仪器设置

1）先打开电脑，再打开定量 PCR 仪主机电源，最后启动 AGS4800 软件，选择对应的层（上、中、下）。

2）点击“新建 ”，在试验名称中编辑实验名、文件路径，保存后点击确定打开一个空白文件。

3）点击对应层次后的“锁头 ”，打开扩增仪器，将反应管放入仪器样品槽内。再点击“锁头 ”，关闭扩增仪器。

4）打开“程序参数 ”窗口，扩增参数如下：

“加液量 ”设定为 60 μL。

4.2.3 BIO-RAD CFX96 Deep Well 仪器设置

1）打开 Bio-rad CFX Manager 软件，选择运行模式为“User-defined”。

2）设置循环条件：

3）点击下一步，编辑版位“Plate”，选择“Create New”，选择上机孔位，选择“Select Fluorophores”后，勾选荧光通 道 FAM 、VIC，

点击“OK”；在“Sample Type”按样本对应顺序设置阴性质控品（NTC）、未知样本（Unknown）、HIV-1 DNA 阳 性质控品（Positive Control）；再为荧光通道 FAM 设置 Target Name 为 1 后勾选，为荧光通道 VIC 设置 Target Name 为 2 后勾选；最后在“Sample Name”一栏中设置样本名称。

4）点击下一步，保存文件，运行程序“Start Run”。

其他适用仪器的设置，请参考仪器使用说明书。

5.  结果研究

运行结束后自动保存结果，按照研究后图像调节 Baseline 的 Start、End 值以及 Threshold（用户可按照实际情 况自行调整，Start 值可以在3~15、End 值可设在 5~20，在 Log 图谱窗口设置 Threshold 的 Value 值，使阈值线位于 扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analysis 自动获得研究结果，在 Report 界面 查看结果，记录未知样本 Ct 值。

6.  质量控制

6.1  阴性质控品：FAM 通道无扩增曲线，VIC 通道有显著扩增曲线且 Ct 值≤35。

6.2 HIV-1 DNA 阳性质控品：FAM 通道有显著扩增曲线，Ct 值在 26~30 范围内；VIC 通道有扩增曲线，Ct 值在 30~34 范围内；

在以上各项同时满足的条件下，本次检测实验有效，否则全部实验应重新开展。

7.  结果判断

7.1 阴性结果判定：要是 FAM 通道无扩增曲线，无 Ct 值或 Ct 值＞43，且在 VIC 通道有显著扩增曲线，Ct 值≤

35，则判断样品为 HIV-1 DNA 阴性。

7.2 阳性结果判定：要是 FAM 通道有扩增曲线，Ct 值≤43，判断样品为 HIV-1 DNA 阳性。

7.3 若 VIC 通道无扩增曲线或 Ct 值＞35，且 FAM 通道也无扩增曲线，则表明样本质量可能存在问题，如样本中存在抑制物，建议确认样本质量后，重新开展实验。

【阳性判断值】

按照临床样本的检测结果，利用 ROC 曲线法最终确定本试剂盒目的基因的阳性判断值为 43；利用 T 检验方 法最终确定本试剂盒内标基因的阳性判断值为 35。

【检验结果的解释】

1. 每次实验前均需检测阴性质控品，HIV-1DNA 阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可开展检测结果 的判定。否则，本次试验无效，建议重新开展检测。

2. 本次试验仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状或其他检测手段。

【检验方法的局限性】

1.  本试剂盒的检测结果仅供临床参考，医生应综合病史、查体及其他辅助检查结果开展临床诊断。

2.  样本浓度超出本试剂盒检测范围的样本无法确保检测结果的准确性。

3.  不可靠的样本采集、转运及处理，以及不当的试验操作与实验环境均有可能结果假阴性或假阳性结果。

4.  服用阻断剂后抑制病毒拷贝，可能存在样本中 HIV-1DNA 浓度低于最低检测限而检测不到的情况。

【产品性能指标】

1. 最低检测限：按照基于临床样本开展最低检测限的确认与验证，最终确定本试剂盒的最低检测限为 250 copies/mL。

2. 阳性符合率：检测 8 份企业阳性参考品（P1～P8），检测结果均为 HIV-1 DNA  阳性。

3. 阴性符合率：检测 7 份企业阴性参考品（N1～N7），检测结果均为 HIV-1 DNA  阴性。

4. 精密度：使用高浓度、低浓度阳性临床样本及阴性临床样本分别开展批内、批间、不同操作者之间、日内、 日间、实验室内与实验室间的精密度检测，检测结果显示：高浓度、低浓度临床样本目的基因 FAM 通道 Ct 值 的变异系数 CV%值均不相较而言更多 5%；阴性临床样本目的基因 FAM 通道 Ct 值均为阴性。

5. 交叉反应及竞争性干扰：检测甲型流感病毒(1×107  copies/mL)、甲型肝炎病毒(1×107  copies/mL)、乙型肝炎病 毒(1×107 IU/mL)、丙型肝炎病毒(1×107 IU/mL)、巨细胞病毒(1×107 copies/mL) 、EB 病毒(1×107 copies/mL)、结核 分枝杆菌(1×107 copies/mL) 、 Ⅰ型单纯疱疹病毒(1×106 TCID50/mL) 、 Ⅱ型单纯疱疹病毒(1×106 TCID50/mL)、水痘 带状疱疹病毒(1×106   TCID50/mL)、马尔内菲青霉菌（马尔尼菲篮状菌）(1×105  CFU/mL)、人乳头瘤病毒(1×107 copies/mL)、人细小病毒 B19(1×106 IU/mL)、白色念珠菌(1×106  CFU/mL)、风疹病毒(1×106  TCID50/mL)、肺炎支 原体(1×106 CFU/mL)、新生隐球菌(1×106 CFU/mL) 、HIV-2 型(1×105 IU/mL)、麻疹病毒(1×106 TCID50/mL)、卡氏 肺孢子菌(1×106  copies/mL)、弓形虫(1×106  copies/mL)、鸟分枝杆菌(1×105  CFU/mL )，检测不在本试剂盒检测范 围内的 HIV-1 型 N 组(1×107   copies/mL)及 HIV-1 型 O 组(1×104   copies/mL)，结果显示：本试剂盒与上述病原体 无交叉反应或竞争干扰。

6. 抗干扰性：检测含有内源性物质的临床样本，包括 16.5 g/dL 血红蛋白、20.0 mg/mL 胆红素、30.0 g/L 甘油三 酯、17.0 g/L 总 G 型免疫球蛋白、3.0 g/L 总 M 型免疫球蛋白、500 IU/mL 类风湿因子（RF）、40 ng/mL 抗核抗体 （ANA）、550 ng/mL 人抗鼠抗体（HAMA），结果显示：上述内源性物质对本试剂盒检测结果均无干扰。检测含 有外源性物质的临床样本，包括 1.5 μg/mL 拉米夫定、24.66 ng/mL 阿得福韦、6.7 ng/mL 恩替卡韦、4.94 μg/mL  替必夫定、14.2 μg/mL α-干扰素、5 mg/L 依法韦仑、13.5 μg/mL 洛匹那韦、5000 ng/mL 多替拉韦钠片、67.5 mg/L  艾博韦泰、13 μg/ml 阿奇霉素、2 mg/L 利巴韦林、3 mg/L 伐昔洛韦、400 ng/ml 奥司他韦、1.2 mg/L 阿昔洛韦、  300 μg/mL 阿司匹林、10 ug/m1 洛索洛芬、19 μg/mL 布洛芬、1 mg/L  甲氧苄啶、9 mg/L 异烟肼、11 mg/L 利福平、 30 μg/mL 阿米卡星、10 mg/L 更昔洛韦、60 μg/ml 磺胺嘧啶、8 mg/L 氟康唑、40 ng/mL 地塞米松与 90 mmol/L  乙醇，检测结果显示：上述外源性物质对本试剂盒检测结果均无干扰。

7. 临床评价：

申请人在 4 家机构开展了临床试验，按照基于试验体外诊断试剂分别与一代测序与临床参考标准开展比对研究。

针对与一代测序的比较研究，共纳入 1269 例样本，二者的阳性符合率为 100%，阴性符合率为 99. 12%。

针对与临床参考标准的比较研究，共纳入 1269 例病例，临床灵敏度为 96.9% ，临床特异度为 100%。

【注意事项】

1.本试剂盒仅用于体外检测。临床实验室应严格按照密切相关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执 行。

2.实验前请仔细阅读本说明书。

3.因为避免样本中任何潜在的生物危险，检测样品应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤与粘膜；样本的处理  建议在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，操作中使用的试管、吸头丢弃前需经灭菌处理。标本的处理与检测  标本的容器、检验过程中使用的材料的处理要符合《病原微生物实验室生物安全通用准则》、《医疗废物管理条例》 与《医疗卫生机构医疗废物管理措施》，以及国家、地区的相关要求。

4.试剂盒中组分需在有效期内使用，不使用本试剂盒提供的组分开展实验将可能结果错误结果。

5.实验人员必须开展专业培训。PCR 实验应分别在样品制备区，试剂准备区，扩增区与产物研究区开展，各区应 相对分隔。人与实验用物品应从试剂准备区、样品制备区、扩增区到产物研究区单向流动，PCR  试剂盒不可存 放于产物研究区。

6.  全程应避免 DNA 酶污染，实验过程中穿工作服，佩戴一次性手套与口罩。在洁净消毒、紫外线灯杀菌的化学 通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道。标本处理区应布置负压超净工作台。实验过程中必须 穿工作服，各实验区工作服应分开。实验过程应戴一次性手套，使用自卸管移液器。

7.所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器与设备，各区各阶段用品不能交叉使用。

8.对每次实验应开展质量控制。

9. PCR 检测试剂使用前要完全解冻，离心数秒后使用，但应避免反复冻融。

10.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；实验完毕应用 10%次 氯酸或 70%酒精或紫外线灯处理工作台与移液器。

11.完成样本核酸提取后，建议马上开展下一步实验，否则请保存于-20±5℃待用（30 天内）。

12.要是在标本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性。

13. 因实验过程中涉及产物开盖等操作步骤，因此建议定期对实验室内的气溶胶开展检测，避免影响实验结果。

【参考文献】

1. Avettand-Fènoël V, Hocqueloux L, Ghosn J, et al. Total HIV-1 DNA, a Marker of Viral Reservoir Dynamics with Clinical Implications. Clin Microbiol Rev, 2016, 29(4):859-880.

2. Rouzioux C, Avettand-Fenoël V. Total HIV DNA: a global marker of HIV persistence. Retrovirology, 2018, 15(1):30.

3. 董莉娟,  陈会超,  马艳玲,  等. HIV-1 DNA 的检测及临床应用 [J] .   中华流行病学杂志, 2022, 43(10) : 1685-1690.

【基本信息】

注册人/生产企业名称：广州达安基因股份有限公司 住所：广州市高新技术产业开发区香山路 19 号

联系方式：

售后服务单位名称：

联系方式：

生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路 19 号；

广州市高新技术产业开发区荔枝山路 6 号；

广州市黄埔区香山路 17 号 B104 号房。

生产许可证编号：粤食药监械生产许 20040999 号

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

【说明书批准日期/生效日期及修改日期】