肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌核酸检测试剂盒创新体外诊断试剂注册技术审评报告

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

由SP/HI/MC-PCR 反应液、SP/HI/MC-酶混合液、SP/HI/MC-阳性对照、SP/HI/MC-阴性对照组成，主要组成成分详见下表。

表1  试剂盒主要组成成分

注：主要组成成分中 SP/HI/MC英文缩写分别代表肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,SP）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae, HI）卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis, MC）

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外定性检测人痰液样本中的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌与卡他莫拉菌核酸。

（三）产品包装规格

48人份/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒按照基于实时荧光PCR与Taqman探针的技术，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌的高度保守区设计的特异性引物与探针，实现对疑似感染患者的痰液样本核酸中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌与卡他莫拉菌核酸的特异性检测。

PCR检测体系含有UDG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解；也含有内源性的内标引物与探针（RNaseP基因），通过检测内标是否正常来监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

1.主要原材料的选择

本产品主要原材料包括引物探针、dNTPs（U）、Taq酶、UDG酶、PCRbuffer、工程菌等。Taq酶由克隆有 Thermus aquaticusDNAPolymerase基因的大肠杆菌表达并经过多步纯化精制得到，UDG酶经过重组质粒转化大肠杆菌后表达纯化获得。

主要原材料均为外购。申请人制定了各主要原材料质量要求并经检验合格。

2.企业参考品设置情况

申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品与精密度参考品。参考品均按照基于临床样本制备而成，阳性参考品来源于不同型别的肺炎链球菌阳性样本6份、流感嗜血杆菌阳性样本6份、卡他莫拉菌阳性样本3份；阴性参考品来源于10 份种属相近的或引起症状相似的病原体，其中包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒阳性样本各 1份；检测限参考品来源于不同型别的肺炎链球菌阳性样本 6份、流感嗜血杆菌阳性样本5份、卡他莫拉菌阳性样本3份；精密度参考品由4 份肺炎链球菌、流感嗜血杆菌与卡他莫拉菌混合样本及1份阴性样本组成。各项企业参考品综合用于产品检测准确性、特异性与精密度、检测限评价。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人通过检测临床样本确定最佳的生产工艺及反应体系，包括对样品处理方式与核酸提取方法、样本用量、洗脱液用量、核酸用量、PCR反应液用量、酶混合液用量开展了研究；对引物、探针、Taq酶（S03）、UDG酶、dNTPs（U）（S01）、MgCl2、PCR buffer等用量开展了优化；对反应条件开展了优化，包括UDG酶反应温度与时间、预变性温度与时间、变性时间与温度、退火与开拓时间与温度、循环数的选择、适用仪器的研究、基线（baseline）与阈值线（threshold）研究。

（三）研究性能评估

本产品研究性能包括企业参考品符合率、最低检出限、特异性（交叉反应、干扰试验）、准确度、精密度、包容性等，申请人提交了6批产品在适用机型上的性能评估资料。

按照基于企业阳性参考品 15份、阴性参考品10份、最低检测限参考品14 份、精密度参考品5 份对本产品开展检验，结果均符合要求。

在准确度研究中，申请人本产品与已上市同类试剂开展比较研究试验，结果显示：阳性符合率为100%、阴性符合率为100%，总符合率100%，表明与已上市试剂的检测结果具有较好的一致性。

最低检出限评估中，申请人对不同型别的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌分别开展梯度稀释，对系列浓度样本分别开展 20  次重复检测，确定以≥95%阳性检出率的浓度水平作为最低检出限；然后对不同型别的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌样本稀释至检出限浓度开展检出限验证，确认最低检出限为200copies/mL。

在精密度研究中，申请人按照基于阴性样本、临界浓度混合阳性样本与中浓度混合阳性样本开展连续20 天的试验，结果表明：阴性样本的结果均为阴性，阴性检出率为100%；临界浓度混合阳性样本阳性检出率为100%；中浓度混合阳性样本的阳性检出率为100%，且检测结果的Ct值的CV值均小于5.0%。

在交叉反应中，对常见其它类似病原体，包括大肠埃希菌、无乳链球菌、A  组链球菌、缓型链球菌、口腔链球菌、唾液链球菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、杜克嗜血杆菌、H1N1（新型甲型H1N1 流感病毒（2009）与季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、乙型流感Victoria、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌、表皮葡萄球菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、博卡病毒、巨细胞病毒、乳酸杆菌属、化脓性链球菌、肺孢子菌开展交叉反应与竞争干扰研究，结果表明本试剂盒与上述其他病原体均无交叉反应，且其他病原体对本试剂盒检测结果无干扰。

在干扰物质评价中，对含干扰物质的低浓度样本开展检测，结果表明经验证的干扰物质（100μg/mL盐酸羟甲唑啉、50μg/mL地塞米松、100μg/mL奥司他韦、100μg/mL扎那米韦、100μg/mL利巴韦林、320μg/mL布地奈德、125μg/mL苯福林、100μg/mL妥布霉素、50μg/mL倍氯美松、100μg/mL氟尼缩松、100μg/mL莫米松、200μg/mL氟替卡松、200μg/mL盐酸组胺、100μg/mL帕拉米韦、100μg/mL莫匹罗星、100μg/mL曲安奈德、60μg/mL氯化钠（含防腐剂）、5μg/mL纯化粘蛋白、5%(v/v)人全血、50μg/mL薄荷脑）对试剂盒的检测结果无显著干扰。

在包容性评估中，申请人对不同型别的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌阳性样本开展研究，结果表明试剂盒包容性满足要求。

（四）阳性判断值或参考区间研究

本产品对240 例临床样本开展ROC曲线研究，确定目的基因的阳性判断值均为40，检测内标的阳性判断值为35。申请人进一步按照基于240例临床样本对阳性判断值的适用性开展验证，结果显示本产品阳性判断值形成可靠。

（五）稳定性研究

申请人对本产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性、37℃加速稳定性、试剂开瓶稳定性、冻融稳定性、运输稳定性以及样本稳定性开展了系统的研究，确定了在各种条件下试剂的有效保存时间。

实时稳定性研究：按照基于三批次试剂储存于-20±5℃条件下，在不同时间点按照技术要求开展检验，确定试剂在-20±5℃条件下，可稳定保存12 个月。

此外，申请人对产品的37℃加速稳定性、试剂开瓶稳定性、

冻融稳定性、运输稳定性以及样本稳定性分别开展了研究，结果显示，产品性能均能满足说明书声称的要求。

三、临床评价概述

申请人在兰州大学第二医院、广州医科大学妇女儿童医疗中心、湖南省人民医院、湖南省儿童医院共 4家机构完成了临床试验。入组病例为具有下呼吸道感染症状/体征等疑似肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌感染的患者，样本类型为痰液。

针对肺炎链球菌与流感嗜血杆菌，按照基于试验体外诊断试剂与已上市同类产品开展比较研究；针对卡他莫拉菌，按照基于试验体外诊断试剂与临床参考方法（一代测序法）与培养鉴定开展比较研究。

针对肺炎链球菌项目，临床试验共计入组病例 816例，其中肺炎链球菌阳性病例 185例，试验体外诊断试剂与已上市同类产品比较的阳性符合率为97.84%（95%CI：94.56%，99.41%），阴性符合率为99.05%（95%CI：97.94%，99.65%）。

针对流感嗜血杆菌项目，临床试验共计入组病例 816例。流感嗜血杆菌阳性病例 257例，试验体外诊断试剂与已上市同类产品比较的阳性符合率为98.83%（95%CI：96.63%，99.76%），阴性符合率为98.21%（95%CI：96.73%，99.14%）。

针对卡他莫拉菌项目，临床试验共计入组病例 816例，卡他莫拉菌阳性病例 159例，试验体外诊断试剂与一代测序比较的阳性符合率为99.37%（95%CI：96.55%，99.98%），阴性符合率为99.24%（95%CI：98.23%，99.75%）。

同时，针对卡他莫拉菌项目，开展了试验体外诊断试剂与卡他莫拉菌培养鉴定的比对研究，共入组 816例，培养鉴定为阳性的病例119  例，临床灵敏度为100%（95%CI：96.95%，100%），特异度为93.69%（95%CI：91.62%，95.38%）。

，该产品临床试验设计符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的相关要求，临床性能满足技术审评要求。

四、产品受益风险判定

按照申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品的上市为适用人群带来的受益相较而言更多风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的避免，需要在说明书中提示以下信息：

1.本试剂盒主要适用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌与卡他莫拉菌病原体感染的辅助诊断，检测结果应结合患者临床症状及其他相关医学检查结果开展综合研究，不得单独作为患者管理的依据，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

2.检验的痰液样本核酸出现序列变异时会存在假阴性风险。

3.不可靠的样本采集、转运及处理以及不当的实验操作与实验环境均有可能结果假阴性或假阳性结果。

4.警示及注意事项：产品说明书中介绍了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。