身为肩负医疗器械注册重任的专家群体，我们在日常工作进程当中时常需要面对那检测试剂参考品设计领域之内所涉及到的合规性方面的一系列问题。尤其是最近这段时间，就企业申报环节来说，一个颇为热点的疑问悄然浮现，即“流感病毒核酸检测试剂阳性参考品究竟能否以混合的方式去开展设置”。而本文将会从结合技术审评所指出的具体要求这个角度出发，对混合型参考品在设置边界以及操作规范等方面展开系统层面的解析工作，尽管可能体现出出的句子完整性并非完全完备。
阳性参考品设置的根本原则
阳性参考品作为一种根本的用于验证试剂检测能力的质控工具，在设计方面所应遵循的要求便是需严格地去匹配那产品所声称且依据现行技术规范而设定的检测范围这一点。
对于甲型流感病毒而言，阳性参考品必须要做到至少覆盖像H1N1与H3N2这样的可归结成两种根本亚型这一要求，这主要是因为HA/NA蛋白的结构在这些亚型之间存在着极为显著的差异，并且这些亚型的毒株在如今流行的毒株之中所占的比例竟然达到了90%以上的这种状况所决定的。
对于被称之为乙型流感病毒的这种病毒而言，在对其开展某些考量与研究的时候，必须将Victoria系以及Yamagata系这两个系列都涵盖在内，要清楚的是，这两系病毒株之间存在一种情况，即它们所具有的基因同源性是低于70%这个数值的，在这种条件之下，针对它们还需开展独立的验证工作，此验证工作不管是出于哪方面的目的，都具有一定的必要性，其重要性不可忽视，然而具体如何实施这种独立验证，实际上又是一个充满变数以及值得深入探讨的问题。注：若试剂声称可检测H5N1、H7N9等罕见亚型，则参考品需额外纳入相应毒株。
混合型参考品的许可情形与限制
混合设置并非绝对禁止，但需符合“跨类型、非竞争”原则：
允许混合的情形
存在着将不同类型病毒开展组合这样一种情形，就好比在考虑到甲型H1N1毒株以及乙型Victoria系毒株这两者之时，之因此能够把它们放置于同一个参考品当中，原因在于涉及到的引物探针之间并不会出现交叉反应的状况，并且其扩增通道之间在某种程度上体现出出相互独立的特性。
在像多联检试剂这种例如其中包括甲/乙流联检之类的特定应用场景当中，“H1N1+Victoria”这种混合参考品被考虑设置从而达到同步去对双靶标检出能力开展验证这一目的的概率被探讨。
禁止混合的情形
同一类型范畴以内所涵盖的不同亚型情况之中，就像在甲型流感领域的H1N1与H3N2这可归结成两种具体亚型，是绝对不可予以混合操作的，这主要是因为它们二者共同使用了一种完全一致的引物探针系统，而一旦出现混合状况之后，极有可能会因为在扩增过程当中产生了彼此竞争的关系，进而结果Ct值出现偏移现象，且这种偏移程度达到了＞±1.5这样的范围，最终可能会出现将弱阳性样本漏检风险加以掩盖的后果情况。
关于同型不同系的毒株而言，尽管乙型Victoria系与Yamagata系从类别归属上属于同一种类型，然而因为在NP基因片段这一方面存在极为显著的差异情况，因此当二者相互混合之后便极有可能出现对分型准确性产生干扰这样一种复杂的、不容易把控与预料的状况。
混合设置规则表
混合类型 | 是否允许 | 典型示例 | 风险原理 |
甲型亚型+乙型系（如H1N1+Victoria） | ✓ | 多联检试剂质控 | 无引物竞争，通道独立 |
甲型不同亚型（如H1N1+H3N2） | ✗ | 甲型通用型试剂 | 扩增竞争致Ct值漂移 |
乙型不同系（如Victoria+Yamagata） | ✗ | 乙型分型试剂 | 同源基因干扰分型特异性 |
限制混合的深层技术原因
扩增效率干扰当H1N1与H3N2混合时，其共用的聚合酶结合位点引发引物竞争。实验显示：若H3N2浓度高于H1N1十倍，后者Ct值平均延迟2.3个循环，最低检出限升高约3倍。
交叉反应风险甲型亚型间存在基因重组可能（如猪流感病毒H1N2），混合参考品无法区分试剂对重组毒株的检测特异性。
质控意义丧失参考品需独立反映各靶标的检测下限（LoD）。若H1N1与H3N2混合，无法判断究竟是哪一亚型未被有效检出。
企业操作实务建议
参考品构建方案
单靶标试剂：每个亚型/系独立设置参考品（如H1N1、H3N2、Victoria、Yamagata分装4份）。
多联检试剂：可设“甲型混合参考品（含H1N1+H3N2）？不允许！但允许设‘甲型H1N1+乙型Victoria’混合品”。
浓度验证要求
当面对各类参考品毒株浓度设定这一任务之时，应让其每一个都务必接近于那代表着试剂LoD数值的2倍情况（就比如若LoD被弄清楚为500 copies/mL 的话，此时就应当将参考品设定在1000 copies/mL 这一水平之上），主要原因在于需极力去避免因处于高浓度的状态而使得原本可能存在的灵敏度缺陷被无情掩盖这种不良状况的出现。
鉴于因不同毒株在培养过程当中所体现出出的效率存在着极大的差异性，因此生物学滴度单位诸如 TCID50 之类被禁止使用，而应按照基于的方式是借助数字 PCR 这一技术手段来对病毒核酸展开定量工作，此方法因不同毒株培养效率差异大故而作出相应禁用及选用策略。
临床样本溯源参考品毒株应源自近3年临床分离株（如中国国家流感中心的年度监测库），非实验室传代株，以确保基因代表性。
结语
流感核酸检测试剂阳性参考品的那种有着特定目的且涉及多方面考量的混合设置，从本质上来讲，其实是一种在技术可行性以及监管所要求的严谨性之间去寻求达到平衡状态的复杂操作过程，在此过程中，之因此允许“跨类型非竞争性混合”这种像甲型与乙型这样的组合方式，目的在于能够有效提升多联检试剂的质控效率；然而，禁止“同类型亚型混合”，诸如H1N1与H3N2这样的搭配，则是因为要防止出现因扩增干扰进而可能结果的对试剂性能产生误判的情况，因此对于企业而言，在开展注册申报这个根本环节的时候，就需要严格地遵循“独立验证根本亚型”这一根本的原则，以此来达到确保检测具备可靠性的目标。
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